マイクロバイオーム・エンジニアリングにおける
CRISPRの役割【ポッドキャスト】

マイクロバイオーム・エンジニアリングにおける科学的ブレークスルーとCRISPRの役割

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）は、海洋細菌のゲノム研究から初めて発見された。ウイルスの脅威に直面したとき、バクテリア細胞はウイルスのDNAフラグメントを捕獲してコピーすることで免疫応答を発達させた。これにより、細菌はその後の攻撃を認識し、ウイルスのDNAを切断してウイルス感染を阻止できるようになった。DNA切断にはCas酵素が関与していることも発見された。この防御機構は後にDoudnaとCharpentierによって活用され、CRISPR-Cas9システムを用いて特異性DNA配列を標的とし、それを単離することができた(1)。

この10年間で、CRISPR-Cas9は創薬や医薬品製造において非常に有用であることが証明された。合成ガイドRNA（gRNA）を用いることで、科学者は特異性のあるDNA配列をターゲットとし、それを切断するためにCas9を用いることができる。その後、宿主の修復機構が非相同末端結合（NHEJ）によってDNAを修復しようとするため、遺伝子機能を変化させるランダムな変異が生じる。このメカニズムを利用することで、科学者は遺伝子を沈黙させ、疾患の表現型における遺伝子の役割を解明することができる。さらに、科学者はCRISPR-Cas9を使って、免疫系回避に関連する遺伝子群を特定することで、薬剤耐性のメカニズムを解明することもできる。

しかし本日は、CRISPRの異なる応用例であるマイクロバイオーム・エンジニアリングを紹介しよう。Molecular Devices社がお届けするDrug Target Reviews Podcastの最新エピソードでは、マイクロバイオーム・エンジニアリングにおけるCRISPRの応用と、ヒト・マイクロバイオーム研究のボトルネックを克服する方法について論じている。

SNIPR Biome社副社長兼デリバリー技術責任者のヤコブ・ハーバー博士と、インフィノーム・バイオサイエンス社共同設立者兼CEO兼CTOのリチャード・フォックス博士が、治療薬やバイオマニュファクチャリングを含むCRISPRの幅広い用途について議論する。

CRISPR-Cas9が疾患におけるヒトマイクロバイオームの役割の探索にいかに役立つか

ヒトの体内には数兆個もの微生物が封じ込められ、その数はヒトの細胞の数よりも多いことが知られている。マイクロバイオームと総称されるこれらの微生物は、細胞外環境を制御し、病原体から細胞を守ることによって、身体と共生を形成している。そのため、マイクロバイオームの乱れが、糖尿病や肥満からがんに至るまで、数多くの病気と密接に関係していることは驚くことではない。

CRISPRが創薬に貢献する方法のひとつに、マイクロバイオームの乱れを緩和するための実装がある。これは、CRISPR-Cas9システムをエンジニアリングし、特異性細菌のDNA配列を切断して病原性細菌を排除することで達成される。SNIPR Biome社は、この目標に向けて積極的に取り組んでいる企業のひとつである。SNIPR Biome社の副社長でCRISPRおよびデリバリー技術部門の責任者であるヤコブ・ハーバー博士は、病原性大腸菌除去へのCRISPRの応用について次のように述べている： 「大腸菌を殺すようにプログラムしたCRISPRを使って、大腸菌を標的にします。現在、細菌感染症の治療には抗生物質が欠かせません。しかし、抗生物質耐性菌が増加し、抗生物質が効かなくなってきています。CRISPRの利点は、抗生物質感受性のバクテリアと抗生物質耐性のバクテリアを区別しないことです』」。また、CRISPRは病原性細菌を特異的にオンターゲットし、健康な腸内細菌叢に不可欠な有益な細菌を温存することができる。

CRISPRの利点と最近の進展

インフィノーム・バイオサイエンスの共同設立者兼CEO兼CTOであるリチャード・フォックスによれば、CRISPRの最大の強みは、ゲノム編集の規模を拡大できることにある。"少数のオンターゲット遺伝子をランダムに変異させるのではなく、経路全体やゲノムを正確に編集し、何十万もの変化を導入することができるようになりました"。

大規模ゲノム編集は、研究者がハイスループットフェノタイプスクリーニングに組み込むことができる市販のセルライブラリーを生み出す。これらのライブラリーは、表現型プロファイルのために多数の遺伝子を手作業でノックアウトする必要性をなくし、創薬研究を加速するソリューションを提案する。

CRISPR技術のもう一つの利点は、特異性の向上である。マイクロバイオーム遺伝子編集は、特異性のメリットを享受している分野のひとつである。CRISPRシステムは、特異性のある細菌のDNAを切断したり、細胞を殺すことなく細菌の細胞壁内の遺伝子回路を除去したりするようにプログラムすることができる。これらの進歩を総合すると、腸内細菌叢の逸脱に対する新規遺伝子治療が推進されることになる。

一方、CRISPRシステムは、デリバリー・ビークルへのパッケージングを容易にするため、より小さな遺伝子構築物の製造を可能にした。したがって、デリバリー・ビークルは、CRISPRに加えて複数のコンポーネントを搭載することができ、DNAの切断や挿入だけでなく、多くのことを達成する多機能遺伝子ベースの治療法を構成することができる。

CRISPR技術製造の加速化

合成生物学と生物工学の間のギャップは、しばしば時間とコストの問題に起因する。バイオマニュファクチャリング・ソリューションを市場に投入するには、インフラ、ロバスト性オートメーション、多くの人材、インストゥルメンテーション、インフォマティクス、そして多くの資本を備えた大規模な事業体が必要となる。そのため、生物製剤の開発に5〜10年、数百万ドルかかることは驚くべきことではない。これはかなりリスキーな投資であるため、製薬会社はしばしば参入をためらい、巨大な治療可能性を秘めた領域が未開拓のまま放置されることになる。

CRISPR対応ゲノム編集システムのセットアップは、ワークフローにおけるボトルネックの一つである。大規模なゲノム・エンジニアリング・システムの設計は非常に手間がかかる。なぜなら、1万座の全ゲノムを標的として正確に編集するためには、微量のドナー配列を作製する必要があるからである。

インフィノーム・バイオサイエンスの共同設立者の一人であるアンドリュー・ガーストは、切断を指示するガイド配列と修復を仲介するドナー配列を対にすることで、広範なゲノム編集をわずか数クリックで行えるようにするという重要な技術革新を思いついた。リチャード・フォックスは、「このような自動設計・構築システムにより、編集済みセルライブラリーを1週間以内に作成することができる。

微生物遺伝子編集のステップ

腸内細菌叢の遺伝子編集の最初のステップは、CRISPRシステムのin vitroバリデーションである。CRISPR編集の特異性は、腸内マイクロバイオームを代表する一連の細菌パネルに対してテストされる。その目的は、CRISPRシステムが細菌の所定の亜種を標的とし、有益な細菌がCRISPRによる遺伝子編集から除外されることを確実にすることである。

その後、検証は前臨床試験と臨床試験に引き継がれる。ゲノム解読技術を用いて、研究者たちは遺伝子編集がマイクロバイオームに有害な影響を与えないことを実証した。もちろん、全ゲノムシーケンスによって明らかになったように、オフターゲット効果は必然的に起こりうる。対策としては、発生率をモニターし、これらの影響が些細なものであり、遺伝子編集の妨げにならないことを確認することである。

シーケンシングと表現型プロファイルは、ゲノムの持つ編集のセットと、細菌集団における一般的な菌株を明らかにする。標的ゲノム編集の成功をさらに検証するために、細菌集団を環境ストレス要因にさらし、その挙動をモニターすることができる。これにより、遺伝子編集が細菌に所望の特性、例えば低酸素などの環境ストレス下で増殖する能力を付与していることが確実になる。

加速されたCRISPRワークフローにより、研究者は何十万もの遺伝子ノックアウトの中から有益な遺伝子編集のセットを引き出すことができる。

CRISPRシステムはまた、特異性研究の必要性に応じて、同じ細菌株を濃縮したり枯渇させたりする柔軟性をも解き放つ。例えば、インフィノームの研究者たちは、食品添加物として使用される重要なアミノ酸であるリジンの生産を拡大するために、大腸菌株をエンジニアリングするためにCRISPRを導入した。一方、SNIPRは同じシステムを使って、血流感染を防ぐために血液がん患者の腸から有害な大腸菌株を根絶した。

CRISPRの未来を見据えて

前述したように、CRISPRは病原性細菌との闘いに力を与える。従来の抗生物質による治療が、有害な細菌と有益な細菌の両方を標的にすることで腸内細菌叢を混乱させることは何度も証明されている。CRISPRは細菌の特異性を高め、ヒトの腸内細菌叢のバランスを維持するのに役立つ。

CRISPRがもたらすもうひとつのExcitationは、治療の可能性を持つ細菌株をエンジニアリングできることである。これは、これまで身体に欠けていた特異的な酵素や代謝産物を発現させることができる細菌を操作することで、マイクロバイオームに遺伝的機能を付加するために使用することができる。

最後に、CRISPRをバイオメディカルやバイオインダストリーエンジニアリングにうまく導入できるかどうかは、「DNAシャッフリング」とも呼ばれるコンビナトリアル編集ができるかどうかにかかっている。特に大規模な微生物系では、スクリーニングの回数を減らすために複数の編集を導入する能力が、バイオ産業生産を実施する上で最も重要になる。

モレキュラー・デバイセズは、CRISPR-Cas9ゲノム編集の当面の目標を加速する最先端技術を提供することで、科学者を支援する。CRISPRで編集されたヒットの正確なライブラリースクリーニングと選択は、マイクロバイオーム・エンジニアリングのワークフローにおいて重要であり、バイオ製造製品の市場への迅速な提供を可能にする。

1. Doudna, Jennifer A., and Emmanuelle Charpentier. "The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9". Science 346.6213 (2014)： 1258096.